4.1.1 试验动物
同第二章
4.1.2 试验仪器
4.1.3 主要试剂
4.1.3.1试剂的配制
0.01 mol/LPBS缓冲液：称取NaCI、KCl、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4分别为4.0 g、0.1 g、1.45 g、0.1 g，加双蒸水定容至500 mL，调pH至7.4，121℃高压灭菌30 min，放入4℃保存备用。
1%多聚甲醛：多聚甲醛1 g，加PBS 100 mL，密封后56℃水浴过夜，次日调pH至7.4，经滤器滤菌后4℃避光保存。
0.4%台盼蓝染液：称取台盼蓝0.4 g，加少许蒸馏水研磨后补水至100 mL，过滤除菌后4℃保存。
0.1% DEPC处理水：取DEPC 1mL加入到1000mL灭菌的双蒸水中，搅拌过夜，次日高压灭菌30min，分装保存即可。
75% 乙醇：75mL乙醇，加入25 mL灭菌的DEPC处理水，现用现配。
4.2 试验方法
4.2.1 试验设计
同第二章
4.2.2 试验基础日粮组成
同第二章
4.2.3 饲养管理
同第二章
4.2.4 样品采集与处理
于试验结束时，每组每个重复随机抽取2只鸡，共12只，称取体重后，断颈宰杀。在无菌的条件下，剖开腹腔，摘取脾脏置于无菌的平皿中，仔细剥离周围的结缔组织后称重；再用灭菌的眼科剪与镊子取1/3脾脏组织，立即浸于预冷的无菌PBS中，待处理以检测淋巴细胞亚群；最后剪取两小块脾脏组织，放于无RNA酶的EP管中，液氮速冻后于-80℃保存。
4.2.5 脾脏免疫指数的测定
根据试验时所测得的蛋鸡体重与脾脏重量，应用下面公式计算脾脏的免疫指数。
脾脏指数（mg/g）=脾脏重量（mg）/体重（g）
4.2.6 T淋巴细胞亚群CD4+、CD8+的测定
4.2.6.1脾脏淋巴细胞悬液的制备
用眼科镊去除摘取脾脏表面的脂肪组织与被膜，经预冷的PBS漂洗3遍后，用眼科剪将脾脏剪碎，再用注射器在200目的尼龙网上轻轻研磨脾脏，吸取2 mL组织滤液，沿管壁缓慢注入，轻悬在等体积的淋巴细胞分离液上，2000 r/min，4℃离心20 min，收集第二层乳白色的淋巴细胞于EP管中，加PBS缓冲液1 mL，1500 r/min，4℃离心15min后弃上清，将淋巴细胞沉淀用含1%胎牛血清的PBS冲洗2次，1000 r/min，4℃离心10 min。T淋巴细胞经血球计数板计数后，应用1%胎牛血清的PBS将细胞配成1×106cells/mL的悬浮液。
4.2.6.2细胞活力的鉴定
吸取100 μL细胞悬液于EP管中，加入等体积的台盼蓝染色液，轻混后染色3~5 min。应用血细胞计数板对染蓝的死细胞与未被染蓝的活细胞进行计数，计算细胞活力，要求淋巴细胞活性≥90%。
4.2.6.3荧光染色
表4.3 荧光抗体染色方法
取淋巴细胞悬液1 mL于EP管中，1200 r/min离心8 min，弃上清，留液体约50 μL，缓慢混匀，按表4.3加入荧光单抗进行染色，混用后4℃避光孵育30 min，1200r/min离心8min，弃上清，沉淀经含1%胎牛血清的PBS洗涤2次后，加入0.5 mLPBS（0.22μm滤膜过滤）重悬，1 h内上机检测（不能及时检测时，用1%多聚甲醛固定液重悬沉淀，4℃避光保存，48 h内检测）。
4.2.7 脾脏IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ mRNA表达量的测定
4.2.7.1脾脏组织总RNA提取
RNA提取准备工作：用蒸馏水配制1‰的DEPC溶液，经猛烈震荡混匀后，于室温静置过夜，一部分DEPC水用于浸泡试验所需的枪头盒、EP管、PCR管、枪头等塑料制品，浸泡过夜以去除RNA酶，高压灭菌后烘干备用；一部分DEPC水经高压灭菌分解后，用于配制75%乙醇和1×TAE试剂；分装若干管灭菌的DEPC水用于溶解RNA沉淀；研钵、药匙、镊子等160℃高温烘烤4~8 h备用。
RNA提取具体步骤：
（1）组织研磨
于-80℃冰箱中取出脾脏组织样品，放入液氮预冷的研钵内，迅速研磨，间歇加入液氮使研钵处于低温状态，研磨10 min，使样品接近粉末状，取50~100 mg组织放于含有1 mlTrizol的EP管中，上下颠倒混匀，室温放置10 min，充分裂解细胞。
（2）相分离加入
200 μL氯仿，盖盖后手动剧烈摇晃15 s，在室温中放置3 min，4℃条件下12 000 ×g离心15min。离心后分三层，小心吸取上层水相400 μL，至另一无RNA酶的EP管中。
（3）RNA沉淀
向含有水相的EP管中加入异丙醇500 μL，摇匀，室温放置10 min，4℃下12 000 ×g离心15 min，即可看到管底部和侧壁有絮状样乳白色RNA沉淀。
（4）RNA洗涤
弃上清，加入预冷的75%乙醇1 mL，充分混匀，室温放置2 min，4℃下8 000 ×g离心5 min。
（5）溶解
RNA弃上清，开盖倒扣于干净的滤纸上，干燥RNA沉淀5~10 min，取0.1% DEPC处理水30 μL重悬RNA沉淀，吹吸溶解。取6 μL RNA溶液用于测浓度与电泳，剩余RNA置于-80℃，待反转录。
（6）RNA质量控制
利用核酸蛋白浓度测定仪测定RNA浓度及OD260/280值，比值保证在1.8~2.0之间，记录RNA浓度。对提取的RNA样品进行变性琼脂糖凝胶电泳，1%琼脂糖凝胶由0.1% DEPC水配制的1×TAE制备。
4.2.7.2样品cDNA合成
（1）按表4.4剂量配制去除基因组DAN反应混合液，在冰上操作。
（2）42℃水浴2 min。
（3）在冰上配制反转录反应液，按反应数+2量配制Master Mix，轻混后吸取10 μL分装到步骤1的反应液中，进行反转录反应。
（4）置于37℃水浴15 min。
（5）立即放于85℃水浴5 s，结束反转录反应。
（6）分装后，-20℃保存备用。
4.2.7.3引物设计与合成
在Gene Bank中找到鸡的IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ和β-actin的mRNA基因序列，利用Primer 5.0和Oligo 6软件设计及验证参考的引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，见表4-6。
4.2.7.4PCR检验引物特异性
以合成的cDNA为模板，对IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ目的基因和β-actin内参进行PCR扩增，检验引物的特异性。反应体系如表4.7。
反应结束后，将PCR产物进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳，并用凝胶成像系统进行观察，比对片段大小，拍照留图。然后对扩增产物进行胶回收（按胶回收试剂盒说明书进行操作），并将回收产物再次进行电泳验证，保证回收产物的准确性。对回收产物进行浓度测定，将核酸浓度超过2μg/μL的胶回收样品与引物一起送到上海生工进行核酸序列的测定，最后将测序结果进行BLAST对比分析。
4.2.7.5荧光定量
每个样品做三个平行，以β-actin为内参，应用2-△△Ct法对目的基因的相对表达水平进行分析。
4.2.8 数据统计
应用SPSS17.0软件对数据进行统计分析，使用One-wayANOVA法分析试验数据的方差，结果以Mean±SD表示；应用Duncan氏多重比较分析数据的统计学差异。P<0.05时为差异显著。
4.3 结果
4.3.1 脾脏免疫指数的检测结果
由表4.9可知，试验A组脾脏指数最高，与对照组相比增加了8.64%，抗生素组值最低，各处理组间差异不显著（P>0.05）。
4.3.2 脾脏淋巴细胞亚群CD4+、CD8+的检测结果
表4.10净力安对蛋鸡T淋巴细胞表面分子CD4+%、CD8+%及CD4+/CD8+的影响
Table 4.10 The effect of Oiloriganum on CD4+%, CD8+% and CD4+/CD8+of lymPhocytes subsets in laying hens
注：同行上标字母相同为差异不显著（P>0.05），肩标含不同小写字母为差异显著（P<0.05）。
Note:The identicallettersmean no difference (P>0.05), thedifferentsmall letters mean significantdifferences (P<0.05)。
表4.10显示，各组之间淋巴细胞亚群CD4+%相比较差异不显著：但试验A组CD4+%高于其余4组（P>0.05）；各组间CD8+%相比较，试验A组与试验B组显著低于对照组（P<0.05）；各组间CD4+/CD8+比值相比较，试验A组显著高于对照组（P<0.05）。图4.1为5个处理组的流式检测散点图结果。
4.3.3 脾脏细胞因子IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ mRNA表达量的检测结果
4.3.3.1总RNA提取结果将各组提取的总RNA进行凝胶电泳检测，由图4.2可知，28 s与18s条带清晰可见，且28 s条带亮度约为18 s条带亮度的2倍，5 s较浅，与总RNA提取标准凝胶图基本一致。使用核酸蛋白浓度测定仪检测提取RNA的OD260/280值，均在1.8~2.0之间，说明提取的各组总RNA片段完整，纯度高，降解少，可进行反转录试验。
4.3.3.2PCR扩增目的基因结果
以反转录得到的cDNA为模板，利用4个目的基因和β-actin内参基因的特异性引物进行PCR反应，扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。结果显示：IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ和β-actin的PCR扩增产物大小与目的片段一致，无引物二聚体，可进行后续试验。图4.3为目的基因PCR产物的电泳结果。
4.3.3.3净力安对脾脏细胞因子mRNA表达量的影响
注：同行上标字母相同为差异不显著（P>0.05），肩标含不同小写字母为差异显著（P<0.05）。
Note:The identicallettersmean no difference(P>0.05), thedifferentsmallletters mean significantdifferences (P<0.05).
IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ mRNA表达水平检测结果见表4.11及分别见图4.4，图4.5，图4.6，图4.7。结果表明：试验A组IL-2 mRNA表达量最高，显著高于对照组与抗生素组（P<0.05）；试验A组与试验B组IL-4 mRNA表达量显著高于抗生素组（P<0.05），且试验A组表达量最高；试验组与抗生素组的IL-10 mRNA表达量与对照组相比均显著下调（P<0.05），但试验A组的IL-10表达量略高于抗生素组与试验B、C组；试验组与抗生素组的IFN-γ mRNA表达量与对照组相比呈下调趋势，其中抗生素组与试验C组显著低于对照组。
4.4 讨论
4.4.1 净力安对蛋鸡脾脏指数的影响
禽类重要的免疫器官有胸腺、法氏囊和脾脏，胸腺是机体与免疫紧密相关的重要淋巴器官，是雏鸡血液中淋巴细胞的来源。法氏囊是禽类特有的中枢免疫器官，可以分化产生B淋巴细胞。脾脏则是禽类最大的外周免疫器官，富含巨噬细胞、树突状细胞和郎罕氏细胞，它是T，B淋巴细胞定居参与细胞和体液免疫的场所之一。免疫器官的发育状况会直接影响机体的免疫水平。Rivas等发现，胸腺、法氏囊和脾脏的重量能够用来衡量雏鸡的免疫状况，免疫器官的重量与机体活重的比值（免疫指数）越大，则机体的细胞和体液免疫机能越强。Grossman也曾指出，免疫器官指数降低是免疫抑制的表现，而免疫器官指数增加是免疫力增强的表现。林清华等研究发现牛至油能显著增加小鼠的脾脏重量。胡晓飞等研究日粮中添加牛至油对肉鸡免疫机能的影响发现，牛至油具有增高免疫器官指数的趋势，法氏囊、脾脏平均增重分别为6.95%、15.25%[119]。王秋梅等在肉鸡饲料中添加75mg/kg牛至油（止痢草精油）发现，对法氏囊的发育无明显影响，但在21日龄添加100 mg/kg、125mg/kg、150mg/kg牛至油能够显著提高法氏囊指数（P<0.05），在肉鸡42日龄时，添加牛至油100 mg/kg还能够显著提高脾脏指数。杜银峰研究发现，止痢草提取物的添加能够显著增加42日龄肉鸡的法氏囊指数，提示止痢草可能具有增强淋巴细胞的免疫作用。而Radwan也发现，在蛋鸡饲料中添加0.5%牛至油使脾脏指数增加了11.46%。由于蛋鸡的免疫器官胸腺和法氏囊随着鸡只的成熟而退化，脾脏则成为成年鸡重要免疫器官，本试验选用30周龄蛋鸡，研究了净力安对蛋鸡脾脏指数的影响，试验结果显示净力安的添加有增加脾脏免疫指数的趋势，与对照组相比增加了8.64%，差异不显著。可能由
于净力安对雏鸡免疫器官的影响较大，对成年鸡器官指数的影响较小。
4.4.2 净力安对蛋鸡脾脏T细胞亚群的影响
T淋巴细胞是家禽体内重要的免疫活性细胞，不仅能够介导细胞免疫，还能对机体的免疫应答进行调节。T淋巴细胞具有杀伤靶细胞、对特异性抗原应答反应、辅助或抑制抗体的产生和产生细胞因子等多种生物学功能，是防止疾病感染，抑制肿瘤形成的重要免疫细胞。T细胞的细胞膜上有很多表面抗原和受体标志，能够与相应的细胞膜结合，它的一种免疫效应形式就是通过与靶细胞特异性结合，直接杀伤靶细胞，另一种则是通过释放淋巴因子，放大和增强免疫效应。T细胞是极其复杂的不
均一体，在同时间段可存在不同阶段或不同功能的亚群，其分类方法亦很多。T细胞根据功能的不同可分为辅助性（Th）、抑制性（Ts）和杀伤性（Tc）T细胞；根据T细胞表面CD抗原的表达不同可分为CD4和CD8阳性细胞群亚群。CD4主要表达于TH，它可通过MHCⅡ类分子识别外源性抗原，CD4+T细胞包括Th0、Th1和Th2，能够促进T、B细胞等增殖与分化、调节免疫反应活性、分泌细胞因子、增强Tc发挥免疫功能，辅助B细胞分化为浆细胞产生抗体；而CD8主要表达于细胞毒性T细胞（CTL），它可与MHC类抗原结合识别内源性抗原，CD8+T细胞包括Ts和Tc，具有免疫抑制和细胞毒性的作用。正常情况下，CD4+/CD8+维持在正常范围内，而CD4+/CD8+比例失衡时，则会造成免疫功能紊乱，影响机体的免疫保护机制，引起免疫缺陷病或自身免疫病。在临床上检测CD4+/CD8+能够反应机体免疫功能的状态[125]，一般由于CD8+细胞增高，导致CD4+/CD8+下降，则反应机体的细
胞免疫处于抑制状态[126]。而刘延等发现，CD4+、CD4+/CD8+的升高，CD8+细胞数量的下降，预示着机体的细胞免疫功能增强。
Ariza-Nieto等在母猪的日粮中添加牛至油，研究其对母猪的免疫状态的影响发现，在7 d和14 d时对CD4%、CD8%和CD4+/CD8+均无显著性影响，但他表明，在先前的研究中发现，牛至油对4和7周龄育肥猪血液中淋巴细胞的CD4%和CD8%均有显著性提升，并指出需要饲喂较长的时间来进行更多的研究[99]。本试验结果表明，添加50mg/kg净力安的试验A组CD4+%有增高的趋势，高于其余试验组与对照组，但差异不显著（P>0.05）；而各组间CD8+%相比较，试验A组与试验B组显著低于对照组（P<0.05）；试验A组的CD4+/CD8+显著高于对照组，差异显著（P<0.05）。从该结果可以看出，净力安降低了CD8+%，升高了CD4+/CD8+，对CD4+%有增高的趋势，说明50 mg/kg净力安的添加对蛋鸡的细胞免疫功能具有增强的效果。
4.4.3 净力安对蛋鸡脾脏主要细胞因子的影响
细胞因子是由多种细胞产生的一组多肽类生物活性物质，具有广泛的生理功能。它们在抗肿瘤、抗感染以及细胞生长、分化上发挥主要作用。体内各细胞因子间存在着相互协同、抑制、诱生的作用，介导各类细胞间的相互作用，协调不同细胞间的功能，进而维持体内免疫应答的有序进行，保持内环境的稳定。Mosmann在1986年发现CD4+T细胞有Th1和Th2两种功能不同的亚群，它们均由Th0分化而成。Th1主要分泌IL-2、IFN-γ等细胞因子，介导细胞免疫反应；Th2主要分泌IL-4、IL-5、IL-10等，介导体液免疫应答。Th1细胞可通过分泌IFN-γ细胞因子抑制Th2细胞的增殖，Th2细胞亦可通过分泌IL-4与IL-10抑制Th1细胞的作用。
IL-2主要由T淋巴细胞产生，以自分泌和旁分泌的方式发挥作用，主要促进T细胞的扩增生长与分化，对免疫应答具有良好的调节作用。除此以外，它还能增强疫苗诱导的免疫反应，协同刺激B细胞的增殖、分化，从而促进抗体的产生；它能够增强NK细胞、单核细胞等杀伤细胞的生物活性，并诱导产生IFN-γ等细胞因子，进一步增强机体的免疫功能。刘第书等报道称挥发油、甙类、多糖、生物碱及健脾补气类中草药等均能促进IL-2的产生。另一个典型的Th1型细胞产生的细胞因子是IFN-γ，主要由T淋巴细胞和NK细胞分泌。它具有较强的免疫调节作用，能够调节T、B淋巴细胞的增殖分化；增强免疫细胞表面抗原与抗体的表达；通过活化巨噬细胞，增强巨噬细胞的抗感染能力，并能增强NK细胞的杀伤力。
IL-4是由Th2细胞分泌的主要细胞因子，其具有多种生物功能。主要作用是促进B细胞的增殖，诱导产生IgG和IgE类抗体，还能维持T细胞的增殖；对单核-巨噬细胞的杀伤功能具有增强的作用。IL-10是Th2细胞分泌的重要的免疫因子，是体内少有的双向免疫调节分子，它具有很强的免疫抑制活性和抗炎活性，能够诱导IL-4等抗炎因子的分泌，通过干预NF-B信号通路降低炎性因子分泌，抑制Th1细胞产生IL-2、IL-6、IFN-γ等促炎因子。此外，它还能刺激B细胞的分化、增殖与抗体的
分泌，因其具有独特的免疫调节作用特点，已成为广大学者的研究热点。本试验中，50 mg/kg净力安的添加能够显著提高蛋鸡脾脏中IL-2 mRNA的表达量，其显著高于对照组与抗生素组（P<0.05）；而对脾脏IL-4 mRAN的表达量影响的研究发现，50 mg/kg净力安组与100mg/kg净力安组均显著高于抗生素组（P<0.05），且50 mg/kg净力安添加组的IL-4 mRNA表达量最高；试验组与抗生素组的IFN-γ mRNA表达量与对照组相比呈下调趋势，50mg/kg净力安组与对照组的IFN-γ mRNA表达量相近，150 mg/kg净力安与抗生素组呈显著下调；试验组与抗生素组的脾脏IL-10mRNA表达量与对照组相比呈显著下调（P<0.05），但50 mg/kg净力安组相对其它试验组略高些。表明净力安对Th1和Th2型细胞的细胞因子分泌均有不同程度的促进的作用，能够保持Th1/Th2间的动态平衡，同时提升机体的细胞免疫和体液免疫功能，且调节因子保持在相对较高的水平，以保证免疫状态的快速调整。从本试验结果可以推测，净力安能够调节并提升蛋鸡的免疫状态。然而细胞因子的分泌是一个复杂的过程，其影响机制还有待于进一步研究。
4.5 小结
日粮中添加净力安可在一定程度上提升蛋鸡脾脏的免疫指数，CD4+%和CD4+%/CD8+%的含量，降低CD8+%的比例；上调脾脏IL-2、IL-4的mRNA表达量，其中以50 mg/kg添加量试验组效果为最好，能最大程度上提升蛋鸡脾脏的细胞和体液免疫功能。
