3.1.1 试验动物
同第二章
3.1.2 试验仪器
XSP-18S光学显微镜：南京江南永新光学有限公司
318MC 型酶标仪：上海三科仪器有限公司
SHP-250 生化培养箱：上海森信实验仪器有限公司
TDL-5-A低速离心机：上海安亭科学仪器厂
ZW-A微量振荡器：上海巨纳科技有限公司
YXQ-LS-50SⅡ立式压力蒸汽灭菌器：上海博讯医疗设备厂
3.1.3 主要试剂
10% EDTA-Na2，0.9%Nacl，瑞氏-吉姆萨染液，禽血细胞稀释液Ⅰ：中性红水100 mL；禽血细胞稀释液Ⅱ：结晶紫12 mg、柠檬酸钠3.8 g、福尔马林0.8 mL、水100 mL；新城疫病毒，阳性血清；鸡免疫球蛋白A（IgA）、IgM、IgG、鸡补体蛋白3（C3）和C4ELISA检测试剂盒：苏州卡尔文科技有限责任公司
3.2 试验方法
3.2.1 试验设计
同第二章
3.2.2 试验基础日粮组成
同第二章
3.2.3 饲养管理
同第二章
3.2.4 样品采集与处理
试验结束的前一天下午对试验鸡进行禁饲处理，次日每组每个重复随机抽取2只鸡，共12只，称取体重并记录。在洁净的实验室进行如下操作：翅下无菌采血10 mL，其中1 mL注入含有20 μL EDTA的EP管中，抗凝后用于血液生理指标的测定；其余注入无抗凝剂的5 mL离心管中，37℃静置30 min后，4℃保存。次日将全血在3000 r/min离心10 min，用移液器小心分离上层血清，分装于1.5 mL EP管中，-20℃保存，检测时避免反复冻融。
3.2.5 血液学指标的测定
红细胞和白细胞计数：禽血细胞稀释液Ⅰ和Ⅱ置于42℃水浴锅中预热，取Ⅰ液1 mL于试管中，加血20 μL，再加Ⅱ液1 mL混匀，在水浴锅中保温约50 s后，充室，计数。计算公式如下：
红细胞总数（个/L）=X×104×106（X为5个中方格的红细胞总数）
白细胞总数（个/L）=X×500×106（X为4个大方格白细胞总数）
白细胞分类计数：血液送到实验室后立即涂片，自然干后用瑞氏染色法进行染色，显微镜下进行分类计数。
3.2.6 血清中IgA、IgM、IgG及补体C3、C4的测定
3.2.6.1ELISA试剂盒测定方法
（1）将试剂盒拿出，在室温下平衡20 min。
（2）洗涤缓冲液与蒸馏水按1：19比例稀释配制洗涤液。
（3）将条板拿出，设置空白孔，标准孔和样品孔。
（4）在标准孔S0~S5中对应加入S0~S5不同浓度的标准品各50 μL。
（5）在样品孔中加入待测样品血清10 μL，再加入混匀的样本稀释液40 μL。
（6）在样品与标准孔中加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100 mL，封板膜封闭反应孔后，37℃恒温60 min。
（7）拿出后垂直弃去液体，滤纸上拍干，避免孔间液体的交叉，在每孔中加满洗涤液，室温静置1 min后，弃去洗涤液，拍干，如此重复5次。
（8）在每个反应孔中加入底物A 50 μL，再加入底物B 50 μL，避光置于37℃中显色15 min。
（9）在每个反应孔中加入终止液50 μL，立即上酶标仪进行检测（<15 min），在450 nm波长处读取各孔的OD值。
（10）应用Excel制作标准曲线，根据标准曲线与样品的OD值计算血清中待检蛋白及补体的浓度。
3.2.7 新城疫抗体滴度的测定
本试验采用红细胞凝集试验（HA）和红细胞凝集抑制试验（HI）试验方法，应用96孔“V”型板反应法进行检测。
3.2.7.1抗体滴度检测具体步骤
（1）1%鸡红细胞悬液的制备取抗免公鸡一只，翅下采血10 mL，加入1 mL 3.8%柠檬酸钠抗凝剂，缓慢混匀后，3000 r/min 离心5 min，吸取弃掉血浆、白细胞和血小板等，剩余红细胞再加生理盐水重悬，洗涤3次，弃去上清。取1 mL的红细胞泥加入99 mL的生理盐水配制成1%的红细胞悬液，现用现配，4℃可保存2-3天，用前需摇匀。
（2）HA的操作过程
A. 在96孔“V”形反应板上各孔均加入生理盐水25 μL；
B. 于第1孔加入新城疫病毒原液25 μL，混匀后吸?25 μL至第2孔，如此进行倍比稀释，至11孔时，混匀后吸弃25 μL，第12孔为阴性对照，不加病毒液。
C. 再向反应板上的各孔依次加入生理盐水25 μL，1%红细胞悬液25 μL，于振荡器上混匀30~60 s后，室温下作用15~30 min，待阴性对照组红细胞沉淀时，即可观察结果。
D. 判定结果：以100%凝集的病毒最大稀释孔为新城疫病毒的凝集价，能使红细胞凝集的最大?毒稀释倍数为该病毒的血凝价，无凝集效应的红细胞将沉于孔底似点状。
（3）HI的操作过程
A. 根据HA试验所得的病毒血凝价配制4单位病毒液；
B. 在96孔“V”形板的各孔中加入25 μL生理盐水；
C. 于第一孔加入被检血清25 μL，混匀后吸取25 μL至孔2，如此倍比稀释至第10孔，混匀后弃掉25 μL；
D. 在96孔“V”形板上，除第12孔各加入4单位病毒液25 μL，第12孔加入阳性血清25 μL；
E. 各孔中依次加入1%鸡红细胞25 μL，振荡器中混匀30~60 s后，室温下作用15~30 min，直至第11孔的4单位病毒已凝集红细胞时观察结果。
F. 结果判定：以100%抑制凝集的血清最大稀释度为该血清的滴度。
3.2.8 统计方法
应用SPSS17.0软件包进行统计分析，数据采用平均值±标准误表示。应用Duncan氏多重比较分析数据的统计学差异。P<0.05时为差异显著。
3.3 结果
3.3.1 蛋鸡血液学指标的检测结果
从表3.1可以看出，试验组的WBC与Lym与对照组相比有增高的趋势，其中以试验A组最高，但差异不显著（P>0.05），血常规检测的其它各项指标，各处理组间均差异不显著（P>0.05），说明净力安的添加对蛋鸡的血液无毒副作用，且有增加血液中免疫细胞的趋势。
3.3.2 蛋鸡血清中IgG、IgM、IgA的检测结果
由表3.2可知，试验A组与试验B组血清中IgG浓度显著高于对照组与抗生素组（P<0.05），试验C组IgG显著高于对照组（P<0.05），其中试验A组的IgG浓度最高；试验A组血清中IgA与IgM浓度高于对照组、抗生素组、试验B、C组，但差异不显著（P>0.05）。
3.3.3 蛋鸡血清中补体C3、C4的检测结果
表3.3净力安对蛋鸡血清中补体的影响
3.3.4 蛋鸡新城疫抗体滴度的检测结果
表3.4净力安对蛋鸡新城疫抗体滴度（log2）的影响
从表3.4可以看出，试验A组的新城疫抗体滴度最高，试验第30 d，试验A组的抗体滴度显著高于对照组（P<0.05），其余组间差异不显著；试验第60 d，试验A组的抗体滴度显著高于对照组与抗生素组（P<0.05），其余各组间无显著性影响。
3.4 讨论
3.4.1 净力安对蛋鸡血液指标的影响
血液是蛋鸡内环境的重要组成部分，当内环境变化时，可能会引起血液的性质或组成成分发生变化。血液指标的检测对机体免疫功能的反应起到重要的作用，同时能够反应出鸡只的适应性与抗病性。血液中的红细胞除了具有运输氧气和二氧化碳的作用外，还具有免疫功能。红细胞对病毒、细菌等病原的侵入，能够产生相应的抗体，并与病原结合形成免疫复合物；红细胞表面的受体还能与血清中的补体结合，将病原带至肝脏等部位进行清除；能够促进吞噬细胞的吞噬作用；红细胞还具有过氧化物酶活性，可直接消灭粘附其表面的抗原异物。现已证实红细胞本身也有完整且独立的自我调控系统，红细胞受体活性类似于白细胞系统免疫改变，是整个免疫系统中的一个子系统。禽类白细胞主要包括淋巴细胞、单核细胞、异嗜性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞，对机体的保护和防御具有重要的作用。异嗜性粒细胞是禽类主要的白细胞，能够吞噬和杀伤入侵病原保护机体，是非特异性免疫系统的重要成员以及调节者，是禽类重要的免疫组织；淋巴细胞具有特异性反应能力，是体内重要的免疫活性细胞，在免疫过程中起到重要作用；单核细胞属于非特异性免疫细胞，具有保护和防御
机体的作用；而嗜碱性粒细胞与嗜酸性粒细胞主要参与过敏反应等。
本次试验研究发现，在蛋鸡饲料中添加净力安，试验组血液中的WBC与Lym在正常范围内与对照组相比有增高的趋势，但差异不显著（P>0.05）；对其它血液指标均无显著影响。说明净力安对蛋鸡血液无毒副作用，且有增加血液免疫机能的趋势。
3.4.2 净力安对蛋鸡血清中IgG、IgM、IgA指标的影响
免疫球蛋白是机体受抗原刺激后所产生的具有抗体活性的一类球蛋白，广泛存在于外分泌液、血液和组织液中，具有抗病毒、抗菌、抗外毒素等免疫功能。对于禽类已确认的免疫球蛋白有IgA、IgM与IgG，也有一些研究证据支持IgD和IgE类似物的存在。家禽体内重要的三种球蛋白IgG、IgM和IgA，是机体参与体液免疫的主要免疫因子，是家禽体对抗病原产生免疫反应的重要表现。免疫球蛋白在禽类免疫过程中发挥重要的作用，其含量的多少能够在一定程度上反映家禽对疾病的抵抗力。IgG是清中免疫球蛋白的主要成分，在初级免疫应答中最持久、含量最高、最重要的抗体，主要由浆细胞（脾脏和淋巴结中）合成，是介导体液免疫的主要成员，具有抗毒素、抗菌、抗病毒等生物学活性，对抗肿瘤上也有一定的免疫作用。IgG是唯一可以通过胎盘屏障的抗体，且家禽的IgG更新速度是人类的4倍，即当有传染或非传染性因素作用时，能在血清中立即检测到IgG合成的变化。有研究发现IgG含量的检测，可用于在工业化饲养条件下的家禽，受各种外源因素作用时，监测家禽免疫球蛋白系统功能的状况。IgM主要在初次免疫应答早期阶段产生，是机体在感染或免疫后产生的先锋抗体，主要分布在血液中。IgM能够结合和活化补体以发挥调理吞噬作用，其抗菌和调理作用明显强于IgG，故在机体早期免疫防御中，IgM占有重要的地位。IgA主要由黏膜相关淋巴组织合成，分为血清型与分泌型两种，是家禽黏膜防御感染的重要免疫球蛋白。血清型IgA能通过清除大量的抗原维持机体内坏境的稳定；分泌型IgA是黏膜免疫的主要效应分子。IgA能够防止微生物入侵消化道、呼吸道等，具有中和病毒和凝集颗粒性抗原的作用。IgA产生含量最少且最迟。
本试验研究发现，添加净力安的试验组血清中的IgG浓度显著高于对照组（P<0.05），且试验组血清中IgM与IgA的浓度有增加的趋势，但差异不显著。Ariza-Niero等研究止痢草提取物对母猪血清中IgG的影响结果发现，试验组IgG较对照组提高了2.9%，对IgA无显著性影响[99]。AlP等研究发现，牛至油的添加对42d肉鸡的IgG有提高的趋势，但差异不显著。在肉鸡日粮中添加500 mg/kg牛至油，其IgG含量与对照组相比有很大的提升，接近差异显著（P=0.067）。林清华曾指出50 mg/kg
牛至油试验组能明显促进小鼠的特异性体液免疫功能[64]。张莉等发现在日粮中添加牛至油，IgG显著提高了9.27% (P<0.05)。而朱晓磊在饲粮中添加百里香精油，研究其对免疫球蛋白的影响发现，0.2~0.3 mg/kg精油组能够极显著提高21 d与42 d麻花鸡血清中IgG、IgM和IgA的水平。从这些研究结果中我们发现，净力安对动物体免疫球蛋白均有不同程度的提升作用，说明净力安能够增强机体的体液免疫功能，结合本试验的研究结果得出添加浓度为50 mg/kg的净力安效果更加明显。
3.4.3 净力安对蛋鸡血清中补体C3、C4的影响
家禽血清中的补体是天然免疫的重要组成部分，能够广泛参与家禽抗微生物防御反应，介导免疫病理的损伤性反应，对机体进行免疫调节，是禽类具有生物学意义的效应及效应放大系统。补体经活化后具有一定的酶活性，能够发挥破坏、溶解细菌、病毒等病原，清除免疫复合物、凋亡细胞等一系列免疫学活性，在抗细菌感染中居中心枢纽地位。补体C3、C4以非活性状态存在于体液和血液中，是补体系统中固有的成分。C3是补体系统中含量最高的成分，主要由巨噬细胞及肝脏合成，它是补体两条重要激活途径的中心环节，补体的经典激活途径和旁路激活途径均需在C3被激活之后，才能进行后续的连锁反应，进而发挥免疫生物学作用。C3含量的高低与补体总含量相平行，故C3的测定既可反应血清中总补体的水平，也是衡量体液免疫的重要指标。而C4是补体经典激活途径的重要组成部分，它的水解物在补体活化、防止免疫复合物沉着、中和病毒和促进吞噬等方面发挥重要的作用。有研究表明，补体活性的大小能够决定机体对病原的抵抗程度。张莉等在肉鸡饲料中添加牛至油研究发现，血清补体C3、C4的含量分别比对照组提高了8.7%和29.7%，且差异显著（P<0.05）[102]。徐奇友等研究大蒜茎粉及牛至香酚对镜鲤的非特异性免疫性能发现，0.1%的牛至香酚能够显著提高血清补体C3、C4的活性（P<0.05）[106]。在本试验中虽未对补体活性进行研究，但在研究结果中发现，添加50 mg/kg净力安的试验A组血清中C3、C4含量最高，与对照组相比分别增加了22.7%、13.6%，但差异不显著（P>0.05）。说明净力安具有增加补体C3、C4的趋势，使补体激活途径更利于进行，进而提高机体的非特异性免疫力，在本试验中添加浓度为50 mg/kg时，效果更为明显。
3.4.4 净力安对蛋鸡新城疫抗体效价的影响
鸡新城疫（New Castle Disease, ND）是由副粘病毒科的新城疫病毒（Newcastle disease vims, NDV）引起的一种急性、败血性、烈性和高度接触性传染病。该病的主要特征是高热、下痢、神经紊乱、呼吸困难和黏膜出血等。鸡群对新城疫病毒的易感率高达100%，发病率和死亡率极高。鸡新城疫被《中国人民共和国动物防疫法》列为一类动物疫病，它对养殖业生产造成巨大的经济损失，危害人体健康。在现代养禽业中，目前对新城疫的防治方法主要是依靠疫苗接种免疫。人们通常利用检测新城疫的抗体滴度，来反应机体的体液免疫性能。抗体滴度值越大，表示抗体浓度越高，进而反应了家禽的体液免疫强弱和健康状况。本研究中，分别在试验的第30 d和60d检测蛋鸡的新城疫抗体滴度，结果发现添加50 mg/kg净力安组的抗体滴度均显著高于对照组（P<0.05），且在60 d时，试验A组抗体滴度显著高于抗生素组。陈会良等研究得到相一致的结果，他发现在饲喂牛至油的第30 d时，成年蛋鸡的新城疫抗体滴度显著高于对照组。朱晓磊等研究表明，0.35 mg/kg的百里香精能够
显著增加42 d麻花鸡的新城疫抗体滴度。胡骁飞等在肉仔鸡日粮中添加100 mg/kg的牛至油发现，在28日龄时，新城疫抗体滴度显著高于速肥大组，而在42日龄时牛至油组显著低于速肥大组，该结果与本试验结果不尽相同，有待进一步研究。而
Malayo.lu的试验结果表明，牛至油对肉鸡的新城疫抗体滴度有增加的作用（P<0.05）。综合以上研究结果可以发现，适量的净力安能够增强禽类对新城疫疫苗诱导的体液免疫功能。
3.5 小结
日粮中添加净力安后，蛋鸡血液中WBC，LYM有增高的趋势；血清免疫球蛋白IgA、IgG、IgM含量和补体C3、C4水平均有不同程度的提高，其中IgG的含量显著增加；血清中新城疫抗体滴度较对照组显著升高，总体上以50 mg/kg添加量试验组效果为最佳，增强蛋鸡血液中特异性及非特异性免疫功能。
