4.1.1 所用仪器表
4-1试验仪器
4.1.2 相关试剂表
4-2试验相关试剂
4.1.3 试验动物及设计
同试验一
4.1.4试验基础日粮组成
同试验一
4.1.5 样品采集与处理每组每重复在试验结束时选取体重接近的鸡→断颈宰杀（宰前不禁食）→剖开腹腔，分离小肠→沿着肠管的纵向剖开，用冷却之后的生理盐水冲洗肠腔内食糜后，吸水纸吸干→分别从卵黄囊遗迹处和十二指肠U状弯曲的结束处逆向向上取4cm的肠段各两段→作为十二指肠和空肠样品→用载玻片一端刮取黏膜 →放入1.5mL离心管中→置于液氮中速冻，-80℃冷冻保存。
4.2 试验方法4.2.1 荧光定量PCR检测的引物设计
荧光定量PCR引物采用Primer Premier5.0软件设计β-actin持家基因和SGLT1、GLUT2、PePT1三个目的基因，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列及参数见表4-3。
表4-3实时荧光定量PCR特异性引物序列及参数
4.2.2 总RNA的提取
使用QIAGEN RNeasyMini Kit（货号：74104）提取肠道粘膜总RNA。配置0.1%DEPC1000mL。
方法：DEPC1mL+999mL双蒸馏水震荡过夜。
（1）实验之前准备工作
用0.1%焦碳酸二乙酯（diethyl Pyrocarbonate，DEPC）过夜浸泡处理试验过程中所用的枪头、离心管、枪头盒等塑料制品去除RNA酶；然后高压湿热灭菌后用鼓风干燥箱烘干；操作前以75%酒精擦拭台面或用灭菌报纸铺于操作台上，操作人员需带手套和口罩，避免外源RNA的污染。实验用烧杯、量筒、锡箔纸、玻璃瓶和镊子等以150℃干烤4小时可去除
RNA酶。试验相关溶液用DEPC处理水配置。研钵用5 %NaOH浸泡一小时，然后用清水冲洗干净再用无水乙醇冲洗三次最后将其放入鼓风干燥箱中180℃烘干8~12 h。
（2）盒子使用之前的注意事项
①如果想要在RNeasy中丰富细胞株或组织净化出RNA，应该加入10μLβ-巯基乙醇（β-ME）到1mL的
RLT缓冲液（Buffer RLT）中，配好的混合液室温存放不能超过一个月。
②向RPE 缓冲液（Buffer RPE）中加入44mL酒精（96%-100%）使其变成工作液体。
（3）具体提取步骤
将肠道粘膜组织从-80 ℃超低温冰箱中取出约30mg以上，置于事先液氮预冷的研钵中，加入液氮迅速研磨，直至样品被研成细小粉末（此过程中要及时添加液氮，始终保持低温），在液氮刚刚挥发完时，取约30mg组织样品，将样品迅速转移到经0.1 %的DEPC水处理过并且经高压蒸汽灭菌的Eppendorf管中（管中事先已装有600μL的Buffer RLT），立即混匀。
裂解物最大速度离心3min。移取上清到另一EP管中。
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将700 μL样品（包括所有沉淀物）转移到1个RNeasy Mini spin 管，将该管放到2mL收集管中，盖上盖子，大于8000×g离心15s后弃掉收集管内的液体。
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加入700μLBuffer RW1到RNeasy Mini spin 管，盖上盖子，大于8000×g 离心15s，弃掉收集管内的液体。
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加入500μLBuffer RPE 到Rneasy Mini spin 管，盖上盖子，大于8000×g 离心15s，弃掉收集管内的液体。
↓
加入500μLBuffer RPE 到Rneasy Mini spin 管，盖上盖子，大于8000×g离心2min，弃掉收集管内的液体。
↓
将Rneasy Mini spin 管放到一个新的1.5mL收集管中，直接加入30-50μLRNase-free的水到Rneasy Minispin 管的膜上（切记触碰到），盖上盖子，大于8000xg离心1min，以洗脱RNA。
↓
如果预期的RNA总量大于30μg，则重复步骤7，再另外加入30-50μLRNase-free的水或者用eluate。
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取灭菌的DEPC水和1 μL RNA样品用于OD值测定。
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取1 μLRNA样品用于1 %的琼脂糖凝胶电泳检测，检测后立即进行反转录，剩余样品置于-80 ℃冰箱中保存，备用。
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1 %的琼脂糖凝胶电泳检测
4.2.3 反转录成cDNA30
（1）基因组
DNA的除去反应
表4-4基因组DNA除去反应体系
（2）反转录反应
向上述反应液中加入以下试剂（反应液的配制在冰上操作）。
表4-5反转录反应体系
4.2.4 SGLT1、GLUT2、PePT1、β-actin 基因的RT-PCR 扩增
以上述步骤合成的单链cDNA为模板，分别利用SGLT1、GLUT2、PePT1基因和β-actin持家基
因的特异性引物进行PCR 扩增。反应体系见表4-6。
表4-6 RT-PCR反应体系
4.2.5
胶回收目的基因
提前称好1.5 mL离心管的重量，将含有目的条带的琼脂糖凝胶放在紫外灯下，小心切下目的条带并且切成小碎块，装入
1.5mL离心管中，将装置好的离心管放于电子天平上称量其凝胶的重量并作记录。将凝胶的重量作为一个凝胶体积。
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将柱子放到收集管中，加入Buffer-GPS平衡液300 μL放置5 min 后离心3 min。
↓
向装有切碎后的凝胶管中加入500μL Birding Buffer放入60℃水浴锅大约7 min，期间上下颠倒混匀约2至3分钟。
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溶胶上柱子，离心10.000×g 1 min，弃液。
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加入300μL Binding Buffer离心10.000×g 1 min，弃液。
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加入700μL Spw wash Buffer离心10.000×g 1 min，弃液。
↓
加入700μL Spw wash Buffer离心10.000×g 1 min，弃液。
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13.000×g空离3 min，将其放置一会。
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30μL ddH2O（事先预热）洗脱柱子上的DNA，水加入后放一会充分反应2min，然后13.000×g离心2 min。
4.2.6目的片段连接
将连接混合液Solution 1从-20 ℃冰箱中取出，将其置于冰水混合物中使其融化。待完全融32化之后，用移液枪取出5μL放置于1.5 mL离心管中。
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向上述1.5 mL离心管中混入4.3μL的胶回收的DNA目的片段产物。
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混入之后向其中加入0.7μL的PMD-18-T载体，上下倒置轻轻混匀。
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用封口膜将上述配好的溶液封好管口，放入16 ℃的恒温连接仪中约10~12 h.过夜。
4.2.7目的片段转化
将感受态细胞从-80 ℃冰箱中取出放于冰水中，待其融化。
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将取出的过夜连接的连接产物至于放入冰水中，将100μL的感受态细胞转入连接产物的离心管中，轻轻上下颠倒数次混匀于冰水中静置30 min。
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离心管放入水浴锅中42 ℃水浴1min，取出后迅速放入冰水中冷却2 min（此过程切记要轻拿轻放）。
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将加入无抗性的LB液体培养基1 mL的离心管至于水平空气浴摇床上37 ℃摇90分钟。
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将离心管置于离心机中6000转1分钟离心，弃去上清液，留约200微升液体，用移液枪轻轻吹打均匀。
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在超净台中操作，用L棒将上管中的液体均匀涂布在氨苄抗性的LB 固体培养基平板上，慢慢干燥20分钟。
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将LB固体培养基放入生化培养箱中倒置放置，37℃培养8~12 h，观察菌落长势如何。
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用移液枪挑取长势良好的单菌落置于3~4 mL的氨苄抗性的液体LB培养基中。将其置于水平空气浴摇床中设置37 ℃培养过夜。
4.2.8 目的片段质粒提取
10000转1分钟离心1~1.5 mL过夜培养的菌液（取菌液在超净台中操作），将上清液尽量吸尽。
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加入250μL无色溶液RB，用移液枪悬浮管底的细菌，使其小的菌块也消失。加入250μL蓝色溶液LB，加完之后轻轻的的上下来回翻转离心管数次，当菌体裂解完全时，管中颜色有半透亮变为透亮的蓝色。注意此过程不易过长，一般为
2分钟。
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加入350μL黄色溶液NB，立即上下来回翻转数次，若中和完全则其管中颜色完全由蓝色变成黄色，带到直至形成黄色的凝块为止，室温下静置2 min（此步用枪在上方快速打出液体，使只有智力复性容易）。
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离心机最少13000转离心10 min，离心之后用移液枪小心吸取上清液转入吸附柱中。
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5000转1 min离心，弃滤液。
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加入650μL无色溶液WB与离心管中，15000转1 min离心，弃去滤液。
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15000转1 min空离，用来彻底去除管中残留的WB液。
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取出吸附柱，将其放入一个干净的离心管中，加入30~50 μL去离子水于柱的中央膜正上方，室温静置1~2 min。
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10000转1 min离心用来洗脱DNA，洗脱液保存于-80 ℃冰箱中，备用
4.2.9 目的片段质粒PCR鉴定
SGLT1、GLUT2、PePT1三个目的片段和β-actin 持家基因的质粒PCR 鉴定反应体系见下表。
表4-7质粒PCR反应体系
4.2.10 实时荧光定量检测标准品的制备
将β-actin持家基因和SGLT1、GLUT2、PePT13个目的基因的重组质粒拿到上海生工测序，测序成功后将其作为标准品。然后用核酸定量仪测定出其相应的浓度，在测定结果中选取A260/A280位于1.8~2.0之间的质粒用来作为标准品，用于荧光定量PCR反应后的数据分析中。根据以下公式计算每微升质粒的拷贝数：拷贝数/μL＝(浓度μg/mL×10-9×6.023×1023×测量体积μL)/(样品体积μL×660×bp数)。
4.2.11 荧光定量PCR
（1）反应体系配制
在Line-Gene K荧光定量PCR仪中按照SYBR. Premix Ex Taq. (PerfectRealTime)试剂盒说明书（购自Takara公司）进行
β-actin持家基因SGLT1、GLUT2、PePT1三个目的基因的实时荧光定量PCR扩增。
表4-8 荧光定量PCR反应体系
（2）质粒原液稀释
10倍梯度稀释质粒原液，将其稀释至原液的10-3~10-8倍。PCR扩增，在荧光定量PCR仪上进行。每个待检基因进行3次重复实验。
PCR反应条件：
每次48孔板上设置不含cDNA模板的用于作空白对照的反应混合物和未知样品。每个循环中的荧光信号采集点为72℃30 s结束时。
（3）实时荧光定量PCR 结果分析
用博日公司荧光定量PCR仪Line-Gene K软件中的双标准曲线法进行相对定量分析β-actin持家基因和SGLT1、GLUT2、PePT1三个目的基因的实时荧光定量PCR扩增产物，以β-actin为内参标定反应结果，计算SGLT1、GLUT2、PePT1的mRNA表达量。采用SPSS 17.0软件对SGLT1、GLUT2、PePT1的mRNA表达量差异进行统计分析。方差分析使用One-WayANOVA法，差异显著后进行Duncan氏多重比较，显著性判断标准以P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著，结果采用平均值±标准误差来表示。
4.3 结果
4.3.1 总RNA提取结果
由图4-1可知，用1%琼脂糖凝胶电泳对提取的总RNA进行检测，总RNA中条带依次为28S、
18SrRNA两条带（由于应用RNeasy处理可富集>200 nt的RNA，RNA产量不包括5S rRNA、tRNAs
或其他小分子RNA），其中28 S条带亮度大约为18 S条带的2倍，条带清晰明亮说明无基因组污染。
使用SmartSPec. Plus核酸蛋白测定仪测定总RNA的A260/280值均位于1.8~2.0之间，说明总RNA
样品完整、降解少，可用于下一步实验操作。
4.3.2 RT-PCR 扩增目的片段结果
以反转录到所获得的cDNA为模板，利用β-actin持家基因和4个目的基因的特异性引物进行PCR扩增，PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳中进行检测。结果显示，SGLT1、GLUT2、PePT1基因以及β-actin持家基因PCR扩增产物的大小与预期结果相符，如图4-2所示，获得了正确的SGLT1、GLUT2、PePT1、
β-actin基因片段。
4.3.3 目的基因的测序结果
菌液样品由上海生工生物工程测序，目的基因SGLT1、GLUT2、PePT1及β-actin基因与Genbank
中匹配率为100%，表明获得了正确的SGLT1、GLUT2、PePT1及β-actin基因阳性克隆质粒。
4.3.4 净力安对小肠粘膜转运载体mRNA表达量的影响
以持家基因β-actin作为内标，SYBRGreenⅠ染料法对SGLT1、GLUT2、PePT1基因进行相对定
量PCR的检测，以下表显示mRNA相对表达量，以下图为SGLT1、GLUT2、PePT1基因各组的相对
表达量对比图。
表4-9 GLUT2 相对表达量（AU）
结果表明，试验Ⅱ组空肠GLUT2mRNA表达量极显著高于其它试验组和对照组（P<0.01）。试验Ⅲ的GLUT2mRNA表达量低于对照组，说明净力安的添加量不是越高越好。
表4-10 SGLT1相对表达量（AU）
结果表明，试验Ⅱ组空肠SGLT1mRNA表达量极显著高于空白对照组和试验Ⅰ组（P<0.01），显
著高于试验Ⅲ组和阳性对照组（P<0.05）。表4-11 PePT1相对表达量（AU）
结果表明，试验Ⅱ组空肠PePT1mRNA表达量极显著高于其它试验组和对照组（P<0.01）。
4.4 讨论
动物生长发育源于能量和蛋白质等营养物质的消化和吸收，小肠前段被公认是营养物质消化吸收的主要场所，EDWARD C[52]等研究表明，肠腔中营养物质的吸收，主要依赖于上皮细胞刷状缘和基底膜不同的载体转运系统，这些转运系统有不同的转运载体所组成，转运载体的活性和数量受到日粮营养、激素及神经内分泌等因素的调控。小肽是氨基酸吸收的主要形式，大部分氨基酸是以小肽的形式通过依赖于H+的I型小肽转运载体（PePT1）在小肠内被吸收[53]。小肠葡萄糖的吸收一般主要分为被动吸收与主动吸收两类，钠葡萄糖转运蛋白1（SGLT1）是参与主动吸收的葡萄糖转运载体，而葡萄糖转运蛋白2（GLUT2）（肠腔微绒毛基底部）主要参与被动吸收[54]。HumPHrey[55]等指出，营养水平的变化和饲料成分对于动物组织的影响主要表现在其营养物质转运载体数量和类型的变化。Ferraris[56]也认为肠腔内日粮信号的改变，可以影响SGLT1的转录，一定时间之后就会增加或降低葡萄糖的吸收。本研究发现，蛋鸡日粮中添加不同含量的净力安对蛋鸡十二指肠和空肠营养物质转运载体mRNA表达量有一定影响，试验Ⅱ组十二指肠和空肠SGLT1、GLUT2和PePT1mRNA的表达量显著高于空白对照和抗生素对照，说明净力安适宜添加量可显著增加营养物质转运载体蛋白的mRNA表达量，提高葡萄糖和蛋白质的吸收能力。可以很好的替代抗生素类饲料添加剂。并且，十二指肠SGLT1、GLUT2和PePT1mRNA的丰度要高于空肠。这说明营养物质转运载体在肠道不同部位表达水平是不相同的，王修启[57]等也认为随着肠道空间位置的后移，SGLT1mRNA的丰度逐步降低。江勇[58]研究表明不同品种的家禽肠道中，肽转运载体PePT1在十二指肠、空肠到回肠的分布规律是十二指肠为最高，依次由空肠到回肠逐步降低。本试验中净力安之所以上调这些基因，可能是消化酶活性提高了，使得肠管内的葡萄糖、氨基酸、小肽的量高了，机体为了适应这一要求，需要提高对应的转运体活性或表达量。
4.5 小结
4.5.1在饲料中添加净力安100 mg/kg 为最适添加量。
4.5.2
在饲料中添加适量净力安能显著上调十二指肠和空肠的SGLT1、GLUT2和PePT1 mRNA的表达，促进葡萄糖和小肽的吸收，从而提高蛋鸡的吸收功能。
